Створення мікробних культур: Комплексний посібник для лабораторій та дослідників у всьому світі

Мікробні культури є фундаментальними інструментами у широкому спектрі наукових дисциплін, від фундаментальних досліджень та біотехнології до науки про довкілля та клінічної діагностики. Здатність успішно культивувати мікроорганізми in vitro є важливою для вивчення їхніх характеристик, проведення експериментів та розробки нових застосувань. Цей комплексний посібник надає детальний огляд принципів та практик, пов'язаних зі створенням та підтриманням мікробних культур, з акцентом на найкращих практиках, усуненні несправностей та міркуваннях безпеки, актуальних для лабораторій у всьому світі.

Розуміння мікробних культур

Що таке мікробні культури?

Мікробна культура — це метод розмноження мікробних організмів шляхом їхнього відтворення у заздалегідь визначеному живильному середовищі за контрольованих лабораторних умов. До мікроорганізмів належать бактерії, гриби, віруси, найпростіші та водорості. Культури можуть бути чистими, що містять лише один тип організму, або змішаними, що містять кілька видів.

Чому мікробні культури важливі?

• Дослідження: Вивчення фізіології, генетики та поведінки мікробів.
• Діагностика: Ідентифікація патогенів у клінічних зразках.
• Біотехнологія: Виробництво фармацевтичних препаратів, ферментів та інших цінних продуктів.
• Наука про довкілля: Аналіз мікробних спільнот у ґрунті, воді та повітрі.
• Освіта: Навчання фундаментальним мікробіологічним технікам.

Основне обладнання та матеріали

Створення успішної лабораторії для культивування мікробів вимагає низки спеціалізованого обладнання та матеріалів:

• Інкубатори: Підтримання стабільної температури та вологості для оптимального росту мікробів. CO2-інкубатори часто використовуються для культур еукаріотичних клітин, що потребують контрольованого рівня CO2.
• Автоклави: Стерилізація середовищ, обладнання та відходів за допомогою пари під високим тиском.
• Ламінарні бокси (бокси біологічної безпеки): Забезпечення стерильного середовища для роботи з культурами, мінімізуючи ризик контамінації. Різні класи боксів біологічної безпеки (клас I, II, III) пропонують різні рівні захисту для користувача, зразка та навколишнього середовища.
• Мікроскопи: Спостереження за морфологією мікробів та оцінка чистоти культури. Фазово-контрастна мікроскопія може бути особливо корисною для перегляду живих, незабарвлених клітин.
• Шейкери/мішалки: Забезпечення аерації та перемішування для рідких культур, сприяючи рівномірному росту.
• Піпетки та мікропіпетки: Точне перенесення рідин.
• Чашки Петрі та пробірки для культур: Контейнери для твердих та рідких культур відповідно.
• Стерильні тампони та петлі: Перенесення та посів культур штрихом.
• Поживні середовища: Забезпечення поживними речовинами для росту мікробів.
• Засоби індивідуального захисту (ЗІЗ): Рукавички, лабораторні халати, захист для очей та маски для забезпечення особистої безпеки.

Типи поживних середовищ

Вибір поживного середовища має вирішальне значення для успішного культивування мікробів. Середовища можна класифікувати за їхнім складом, консистенцією та призначенням.

За складом

• Визначені середовища (синтетичні середовища): Містять точно відомі хімічні компоненти. Корисні для вивчення специфічних потреб у поживних речовинах. Приклад: мінімальне середовище M9 для E. coli.
• Комплексні середовища (натуральні середовища): Містять інгредієнти невідомого хімічного складу, такі як дріжджовий екстракт, пептон або яловичий екстракт. Забезпечують широкий спектр поживних речовин і підтримують ріст багатьох мікроорганізмів. Приклад: поживний бульйон або бульйон Луріа-Бертані (LB).

За консистенцією

• Тверді середовища: Містять тверднучий агент, зазвичай агар. Використовуються для виділення чистих культур та спостереження за морфологією колоній. Приклад: поживний агар або агар МакКонкі.
• Рідкі середовища (бульйони): Не містять тверднучого агента. Використовуються для вирощування великих кількостей мікроорганізмів. Приклад: триптично-соєвий бульйон (TSB).
• Напівтверді середовища: Містять низьку концентрацію агару (зазвичай <1%). Використовуються для тестування рухливості.

За призначенням

• Селективні середовища: Містять інгредієнти, що пригнічують ріст певних мікроорганізмів, дозволяючи іншим рости. Використовуються для виділення специфічних типів мікроорганізмів зі змішаної популяції. Приклад: агар МакКонкі (селективний для грам-негативних бактерій) або манітоло-сольовий агар (MSA), який є селективним для видів Staphylococcus та диференціює *Staphylococcus aureus* від інших *Staphylococcus* на основі ферментації манітолу.
• Диференціальні середовища: Містять інгредієнти, що дозволяють розрізняти різні типи мікроорганізмів на основі їхньої метаболічної активності. Приклад: кров'яний агар (диференціює бактерії за гемолізом) або агар з еозином та метиленовим синім (EMB), який диференціює E. coli (металевий зелений блиск) від інших коліформних бактерій.
• Збагачувальні середовища: Містять специфічні поживні речовини, що сприяють росту певного мікроорганізму, дозволяючи йому випереджати інші організми у зразку. Вони використовуються, коли цільовий організм присутній у низькій кількості. Приклад: селенітовий бульйон, що використовується для збагачення видів *Salmonella*.

Приклад: Вибір правильного середовища для культури *E. coli* Щоб виростити загальну культуру *E. coli*, зазвичай використовують LB бульйон або агар. Якщо ви хочете виділити штами *E. coli*, які можуть ферментувати лактозу, ви можете використовувати агар МакКонкі. Якщо ви вивчаєте специфічні метаболічні шляхи, ви можете використовувати визначене середовище, таке як M9, для контролю доступних поживних речовин.

Етапи створення мікробної культури

Процес створення мікробної культури зазвичай включає наступні етапи:

1. Приготування поживного середовища

Підготуйте відповідне поживне середовище згідно з інструкціями виробника або встановленими лабораторними протоколами. Це зазвичай включає:

• Зважування необхідних інгредієнтів.
• Розчинення інгредієнтів у дистильованій або деіонізованій воді.
• Коригування pH до бажаного рівня.
• Додавання агару (якщо готуєте тверді середовища).
• Стерилізація середовища шляхом автоклавування.

Критичні міркування:

• Точність: Точні вимірювання мають вирішальне значення для відтворюваних результатів. Використовуйте калібровані ваги та об'ємний скляний посуд.
• Стерильність: Переконайтеся, що всі компоненти середовища та посуд для приготування є стерильними, щоб запобігти контамінації.
• Коригування pH: Перевірте pH середовища за допомогою каліброваного pH-метра. Більшість бактерій оптимально ростуть при нейтральному pH (близько 7,0). Гриби часто віддають перевагу трохи кислим умовам.

2. Стерилізація

Стерилізація необхідна для знищення будь-яких небажаних мікроорганізмів, які можуть забруднити культуру. Поширені методи стерилізації включають:

• Автоклавування: Використання пари під високим тиском при 121°C протягом 15-20 хвилин. Це найпоширеніший метод стерилізації середовищ, обладнання та відходів.
• Фільтраційна стерилізація: Пропускання рідин через фільтр з розміром пор, достатньо малим для видалення мікроорганізмів (зазвичай 0,22 мкм). Використовується для термочутливих розчинів, які не можна автоклавувати. Приклад: стерилізація розчинів антибіотиків.
• Стерилізація сухим жаром: Використання високих температур (160-180°C) протягом 1-2 годин. Використовується для стерилізації скляного посуду та інших термостійких предметів.
• Хімічна стерилізація: Використання хімічних дезінфектантів, таких як етанол або відбілювач, для стерилізації поверхонь та обладнання.

Найкращі практики для автоклавування:

• Переконайтеся, що автоклав належним чином обслуговується та калібрований.
• Не перевантажуйте автоклав.
• Використовуйте відповідні контейнери для автоклавування рідин, щоб запобігти википанню.
• Дайте автоклаву повністю охолонути перед відкриттям, щоб уникнути опіків.

3. Інокуляція

Інокуляція — це процес введення бажаного мікроорганізму в стерильне поживне середовище. Це можна зробити за допомогою різних технік, залежно від джерела інокулюму та типу культури, що готується.

• З чистої культури: Перенесення невеликої кількості існуючої культури на нове середовище за допомогою стерильної петлі або тампона.
• Зі змішаної культури: Ізоляція окремих колоній на твердому середовищі шляхом посіву штрихом для ізоляції.
• З клінічного зразка: Нанесення зразка тампоном на середовище або суспендування зразка в рідкому середовищі.
• З екологічних зразків: Використання серійних розведень та методів висіву на чашки для отримання підраховуваних колоній.

Посів штрихом для ізоляції: Ця техніка використовується для отримання чистих культур зі змішаної популяції бактерій. Вона полягає в розведенні бактеріального зразка шляхом його багаторазового нанесення штрихами по поверхні твердої агарової чашки. Мета полягає в отриманні добре ізольованих колоній, кожна з яких походить від однієї бактеріальної клітини.

Приклад: Посів штрихом для ізоляції *E. coli* 1. Стерилізуйте петлю, прожарюючи її до червоного кольору, а потім дайте їй охолонути. 2. Занурте петлю в зразок, що містить *E. coli*. 3. Проведіть петлею по одній секції агарової чашки. 4. Знову прожарте петлю і остудіть її. 5. Проведіть штрих від першої секції до другої, переносячи частину бактерій. 6. Повторіть процес прожарювання та посіву для третьої та четвертої секцій. 7. Інкубуйте чашку при 37°C протягом 24-48 годин. Ізольовані колонії повинні утворитися в останніх секціях посіву.

4. Інкубація

Інкубація передбачає забезпечення відповідних умов навколишнього середовища для росту мікробів. Це зазвичай включає контроль:

• Температури: Більшість бактерій оптимально ростуть при 37°C (температура людського тіла), але деяким можуть знадобитися нижчі або вищі температури. Гриби часто віддають перевагу нижчим температурам (25-30°C).
• Атмосфери: Деякі мікроорганізми потребують специфічних атмосферних умов, таких як наявність або відсутність кисню або підвищений рівень вуглекислого газу. Аеробні бактерії потребують кисню для росту, тоді як анаеробні бактерії не переносять кисень.
• Вологості: Підтримання достатньої вологості запобігає висиханню середовища.
• Часу: Час інкубації залежить від мікроорганізму та поживного середовища. Бактерії зазвичай ростуть швидше, ніж гриби.

Міркування щодо інкубації:

• Контроль температури: Використовуйте калібровані інкубатори для забезпечення точного контролю температури.
• Контроль атмосфери: Використовуйте анаеробні банки або CO2-інкубатори для створення специфічних атмосферних умов.
• Моніторинг: Регулярно контролюйте культури на предмет росту та контамінації.

5. Моніторинг та підтримання

Регулярний моніторинг є важливим для забезпечення правильного росту культури та її захисту від контамінації. Це включає:

• Візуальний огляд: Перевірка на ознаки росту, такі як помутніння в рідких середовищах або утворення колоній на твердих середовищах.
• Мікроскопічне дослідження: Спостереження за морфологією клітин та оцінка чистоти культури. Фарбування за Грамом є поширеною технікою для диференціації бактерій.
• Субкультивування: Перенесення частини культури на свіже середовище для підтримання життєздатності та запобігання виснаженню поживних речовин.
• Зберігання: Консервація культур для тривалого зберігання шляхом заморожування або ліофілізації (сублімаційного сушіння).

Асептична техніка: запобігання контамінації

Асептична техніка — це набір процедур, призначених для запобігання контамінації культур та підтримання стерильного середовища. Ключові принципи асептичної техніки включають:

• Робота в ламінарному боксі: Забезпечення стерильного робочого простору.
• Стерилізація обладнання: Прожарювання петель та голок, автоклавування середовищ та скляного посуду.
• Використання стерильних матеріалів: Використання попередньо стерилізованих одноразових матеріалів або стерилізація багаторазових матеріалів перед використанням.
• Мінімізація контакту з повітрям: Працювати швидко та ефективно, щоб мінімізувати час, протягом якого культури піддаються впливу повітря.
• Належна гігієна рук: Ретельно мити руки до і після роботи з культурами.

Приклади асептичної техніки на практиці:

• Відкриття стерильної чашки Петрі: Лише злегка піднімайте кришку, щоб мінімізувати контакт з повітрям.
• Перенесення культури: Прожарюйте горлечко пробірки з культурою до і після перенесення культури.
• Приготування середовища: Використовуйте стерильну воду та скляний посуд, і автоклавуйте середовище одразу після приготування.

Усунення поширених проблем

Незважаючи на ретельне планування та виконання, під час створення мікробних культур іноді можуть виникати проблеми. Ось деякі поширені проблеми та їхні можливі рішення:

• Немає росту:
  • Можлива причина: Неправильне поживне середовище, неправильна температура інкубації, нежиттєздатний інокулюм, наявність інгібіторів.
  • Рішення: Перевірте, чи відповідає поживне середовище мікроорганізму, перевірте температуру інкубації, використовуйте свіжий інокулюм та переконайтеся у відсутності інгібіторів у середовищі.
• Контамінація:
  • Можлива причина: Погана асептична техніка, забруднені середовища або обладнання, забруднювачі з повітря.
  • Рішення: Перегляньте та вдоскональте асептичну техніку, належним чином стерилізуйте всі середовища та обладнання, працюйте в ламінарному боксі. Використовуйте антибіотики або антифунгальні препарати в середовищі (за потреби) для пригнічення росту контамінантів.
• Повільний ріст:
  • Можлива причина: Неоптимальні умови росту, виснаження поживних речовин, накопичення токсичних побічних продуктів.
  • Рішення: Оптимізуйте умови росту (температура, атмосфера, pH), забезпечте свіже середовище та аеруйте культуру для видалення токсичних побічних продуктів.
• Змішана культура:
  • Можлива причина: Контамінація вихідного інокулюму, неповна ізоляція під час посіву штрихом.
  • Рішення: Отримайте чисту культуру з надійного джерела, повторіть посів штрихом для ізоляції та використовуйте селективні середовища для пригнічення росту небажаних мікроорганізмів.

Міркування щодо безпеки

Робота з мікроорганізмами вимагає дотримання суворих протоколів безпеки для захисту персоналу та запобігання викиду потенційно шкідливих організмів у навколишнє середовище.

Рівні біобезпеки

Мікроорганізми класифікуються за рівнями біобезпеки (BSL) на основі їхнього потенціалу викликати захворювання. Кожен BSL вимагає специфічних практик утримання та захисного обладнання.

• BSL-1: Мікроорганізми, які невідомі як збудники захворювань у здорових дорослих. Приклад: Bacillus subtilis. Вимагає стандартних мікробіологічних практик та ЗІЗ.
• BSL-2: Мікроорганізми, що становлять помірний ризик захворювання. Приклад: Staphylococcus aureus. Вимагає практик BSL-1 плюс обмежений доступ, попереджувальні знаки про біологічну небезпеку та заходи безпеки при роботі з гострими предметами. Робота з аерозолями повинна проводитися в боксі біологічної безпеки.
• BSL-3: Мікроорганізми, які можуть викликати серйозні або потенційно летальні захворювання при вдиханні. Приклад: Mycobacterium tuberculosis. Вимагає практик BSL-2 плюс контрольований доступ, спрямований потік повітря та захист органів дихання. Вся робота повинна проводитися в боксі біологічної безпеки.
• BSL-4: Мікроорганізми, які є надзвичайно небезпечними та становлять високий ризик життєво небезпечних захворювань. Приклад: вірус Ебола. Вимагає практик BSL-3 плюс повна ізоляція, спеціалізовані системи вентиляції та захисні костюми для всього тіла.

Загальні практики безпеки

• Носіть відповідні ЗІЗ: Рукавички, лабораторні халати, захист для очей та маски.
• Дотримуйтесь належної гігієни рук: Ретельно мийте руки до і після роботи з культурами.
• Деконтамінуйте робочі поверхні: Дезінфікуйте поверхні відповідним дезінфектантом до і після використання.
• Належним чином утилізуйте відходи: Автоклавуйте або спалюйте забруднені відходи.
• Повідомляйте про розливи та нещасні випадки: Дотримуйтесь встановлених протоколів для звітування та ліквідації розливів.
• Пройдіть належне навчання: Переконайтеся, що весь персонал навчений мікробіологічним технікам та процедурам безпеки.

Довготривале зберігання культур

Зберігання мікробних культур для довготривалого використання має вирішальне значення для підтримання цінних штамів та уникнення необхідності повторно ізолювати та культивувати організми. Поширені методи зберігання включають:

• Охолодження: Зберігання культур при 4°C для короткочасного зберігання (тижні до місяців).
• Заморожування: Зберігання культур при -20°C або -80°C з кріопротекторним агентом, таким як гліцерин. Цей метод може зберігати культури протягом років.
• Ліофілізація (сублімаційне сушіння): Видалення води з культури шляхом заморожування, а потім сушіння під вакуумом. Цей метод може зберігати культури протягом десятиліть.

Найкращі практики для заморожування культур:

• Використовуйте кріопротекторний агент для запобігання утворенню кристалів льоду, які можуть пошкодити клітини. Гліцерин є поширеним кріопротекторним агентом.
• Заморожуйте культури повільно, щоб вода могла вийти з клітин. Використовуйте морозильник з контрольованою швидкістю заморожування або помістіть культури в морозильник при -20°C на кілька годин перед перенесенням до -80°C.
• Зберігайте заморожені культури в кріопробірках з герметичними кришками.
• Чітко маркуйте пробірки назвою штаму, датою заморожування та будь-якою іншою відповідною інформацією.

Висновок

Створення та підтримання мікробних культур є фундаментальною навичкою для дослідників, клініцистів та освітян по всьому світу. Розуміючи принципи асептичної техніки, обираючи відповідні поживні середовища та впроваджуючи належні протоколи безпеки, ви можете успішно культивувати мікроорганізми для широкого спектра застосувань. Цей посібник надає комплексну основу для розбудови вашого досвіду в техніках культивування мікробів та сприяння прогресу в різних наукових галузях. Пам'ятайте, що послідовна практика, ретельна увага до деталей та прихильність до безпеки є важливими для досягнення надійних та відтворюваних результатів.